Personagem de animação, a primeira aparição do Rato Mickey foi na curta-metragem Steamboat Willie (1929), produzida por Walt Disney. Este filme de animação foi o primeiro do género a utilizar som e elevou a personagem de Mickey a um dos mais populares do século XX.

Secundado pela namorada Minnie e pelo arqui-inimigo João Bafo de Onça, Mickey foi elaborado por Disney como um agente cómico ativo influenciado pelo slapstick colocado em voga por Charles Chaplin. O tom burlesco daquela curta-metragem foi bem recebido pelo público infantil, mas as associações de pais demonstraram o seu descontentamento pela irreverência de Mickey, inundando o escritório de Disney com veementes cartas de protesto, mostrando-se chocados com as cenas do filme onde Mickey surgiu a utilizar a cauda de um bode como caixa de música ou os dentes de uma vaca como xilofone.

Tentando agradar a uma franja mais generalista do público americano, as futuras curtas-metragens revelaram um Mickey mais agradável e com um comportamento temperado.

Em 1938, Disney criou a personagem de Pluto, cão de Mickey, procurando com essa iniciativa criar uma imagem mais familiar do rato, dotando-o de características humanizadas. No início da década de 40, Mickey era a personagem de animação mais popular competindo nesse campo com o Pato Donald, Bugs Bunny e Porky Pig da Warner Bros. As tiras diárias protagonizadas por Mickey esgotavam jornais e as suas curtas-metragens enchiam cinemas, agradando a públicos de todas as idades.

A sua presença na longa-metragem Fantasia (1940), liderando o sketch "O Aprendiz de Feiticeiro", foi o ponto alto de uma obra que procurou fazer a simbiose entre a animação e a música clássica, mas que, por ser um produto claramente avançado para a época, não foi bem recebida pelo público. A popularidade granjeada por Mickey levou mesmo a que uma missão Aliada na Segunda Guerra Mundial fosse batizada com o seu nome.

Brevemente, surgiriam outras personagens coadjuvantes: os amigos Pateta, Horácio, Clarabela e Coronel Cintra, os sobrinhos Chiquinho e Francisquinho e os inimigos Mancha Negra e Ranulfo.

A partir de meados da década de 50, em plena Guerra Fria, as tiras de Mickey conferiram-lhe um estatuto de herói de policiais, apresentando-o como detetive e combatente do crime na cidade de Patópolis ou então como coadjuvante de Sir Lock Holmes (uma sátira à personagem criada por Arthur Conan Doyle).

Em Portugal, começou a ser publicada em 1980 uma revista com o seu nome, embora a maioria das histórias fossem da autoria de desenhadores norte-americanos e brasileiros.